Поиск в базе сайта:
Задача этой рождающейся науки научиться получать гены белков, исполняющих любые наперед заданные функции. Естественным следст­вием развития белковой инженерии должно стать получение важных для практики белков и пептидов с улучшенными или даже новыми свойст­вами. icon

Задача этой рождающейся науки научиться получать гены белков, исполняющих любые наперед заданные функции. Естественным следст­вием развития белковой инженерии должно стать получение важных для практики белков и пептидов с улучшенными или даже новыми свойст­вами.




Скачать 142.96 Kb.
НазваниеЗадача этой рождающейся науки научиться получать гены белков, исполняющих любые наперед заданные функции. Естественным следст­вием развития белковой инженерии должно стать получение важных для практики белков и пептидов с улучшенными или даже новыми свойст­вами.
Дата конвертации04.05.2015
Вес142.96 Kb.
КатегорияЗадача

На основных направлениях науки

102


Кандидат физико-математических наук А. В. ФИНКЕЛЫПТЕЙН,

доктор

биологических наук

М. П. КИРПИЧНИКОВ,

доктор физико-математических наук О. Б. ПТИЦЫН,

доктор

биологических наук

К. Г. СКРЯБИН

КОНСТРУИРОВАНИЕ

БЕЛКОВЫХ

МОЛЕКУЛ

Подход к изучению структуры и функ­ции белков в настоящее время принципиально меняется. Это происходит, главным образом, благодаря трем обстоятельствам.

С одной стороны, развитие методов олигопуклеотидного синтеза и тех­ники рекомбинантных ДНК сделали принципиально возможным создание и экспрессию генов для получения больших количеств любых белков, как «природных», так и «новых», не существовавших ранее в природе. С дру­гой стороны, физические методы исследования дали в руки молекулярных биологов мощный инструмент для изучения структуры, функции и дина­мики белков. И, наконец, применение ЭВМ и компьютерной графики по­зволило «вступить в диалог» с пространственными структурами белковых молекул, быстро и наглядно представить себе вероятные структурные, а иногда и функциональные последствия тех или иных модификаций аминокислотных последовательностей. Объединившись, чтобы создавать новые белки с заданной структурой и функцией, эти столь разные под­ходы привели к рождению новой области молекулярной биологии — бел­ковой инженерии.

Задача этой рождающейся науки — научиться получать гены белков, исполняющих любые наперед заданные функции. Естественным следст­вием развития белковой инженерии должно стать получение важных для практики белков и пептидов с улучшенными или даже новыми свойст­вами. Для медицины, по-видимому, наиболее привлекательно получение белковых гибридов, где одна молекула сочетает в себе биохимические (в частности, иммунологические) функции нескольких белков. В различ­ных промышленных процессах, в которых условия часто весьма далеки от физиологических, заманчивые перспективы открывает возможность на­правленного изменения таких свойств белков, как оптимум концентрации водородных ионов и температурный оптимум функционирования, термо-стабилышсть, протеазная устойчивость, субстратная специфичность, за­висимость от кофакторов и аллостерическая регуляция, кинетические свойства и т. д. Особый интерес представляет возможность создания в белках «новых» активных центров, о которой будет сказано далее.

Белковая инженерия, дающая возможность целенаправленного экспе­риментирования с белковыми молекулами, может ответить также па

^ Конструирование белковых молекул

103

фундаментальные вопросы. Возможно ли в принципе узконаправленное изменение пространственной структуры пли попытка такого изменения будет приводить к драматическим и непредсказуемым последствиям в организации всего белка? Осталась ли в результате эволюции возмож­ность существенной оптимизации тех или иных свойств белковой моле­кулы? Возможно ли создание ферментов для технологически важных, но отсутствующих в живой природе реакций?

В принципе, существуют три способа получения искусственного белка с заданной аминокислотной последовательностью: химический синтез са­мого белка, синтез матричной РНК с последующим получением желае­мого белка в бесклеточной белоксинтезирующей системе и синтез гена (ДНК) с его последующим внедрением в клетку. В настоящее время ос­новные усилия «белковых инженеров» сосредоточены на третьем пути — пути, который использует сама природа.

Генетическая инженерия предлагает различные способы получения генов новых белков. Например, можно получить «гибридные» (составные) белки при помощи ферментативной сшивки полных генов или их частей. Многие гибриды, полученные сшивкой генов, сохраняют функции своих составных частей. Так, например, гибриды р-лактамазы и ^-галактози-дазы с целевыми белками традиционно используются как маркеры для изучения экспрессии целевых белков. Недавно был получен очень инте­ресный гибрид интерферона и интерлейкина, сохранивший активности составных частей '.

В лабораторных условиях синтезируются и полные гены небольших белков при помощи фермептативной сшивки 15—20-членных олигонук-леотидов с заданной последовательностью (синтез таких олигонуклеоти-дов в настоящее время не вызывает особых проблем; можно производить и множественные модификации гена, сшивая модифицированные олиго-нуклеотидные блоки). Метод достаточно дорог и трудоемок, поскольку требует больших количеств (20—100 мкг) каждого из олигонуклеотидов, но для синтеза генов маленьких белков он нашел широкое применение. Так были синтезированы de novo и экспрессироваиы с высоким выходом гены многих пептидных гормонов и ряда ферментов.

Однако для получения точечных замен, коротких вставок и делеций наиболее удобен метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Он основан на гибридизации синтетического олигонуклеотпда — праймера (затравки) длиной 15—20 оснований и соответствующего участка клони­рованного гена природного белка. Праймер комплементарен модифици­руемому участку природного гена повсюду, за исключением места моди­фикации. В этом положении он содержит нуклеотиды, комплементарные кодону вводимого в белок остатка. После гибридизации, используя ДНК-полимеразу, реплицируют оставшуюся (немодифицируемую) часть гена. Точно так же вводятся через праймер делеций и вставки. Безусловное достоинство этого метода в том, что он строго направлен и требует не­больших количеств (около 2 мкг) синтетического праймера. Частота му­таций не превышает нескольких десятков процентов, в зависимости от экспериментальной процедуры введения замены.

Чтобы работать целенаправленно, необходимо знать детальную про­странственную структуру по крайней мере исходного белка (а для полно­го контроля результатов — и пространственную структуру получаемых мутаптных белков). Основной метод получения этой информации — рент-геноструктурный анализ, причем знание структуры исходного белка зна­чительно облегчает расшифровку структуры его модифицированных ва-

1 Seno Н. е. а. II FEBS Lett, 1986. V. 199. Р. 188-192.

На основных направлениях науки

104

риантов. Аналогичную роль для исследования структуры и динамики белков в растворе могут сыграть и современные методы ядерного магнит­ного резонанса. Наконец, теория пространственных структур белков в ряде случаев уже сейчас позволяет предсказать как общее строение скон­струированного белка, так и структурные последствия точечных модифи­каций аминокислотных последовательностей.

Начало экспериментальной белковой инженерии относится к 1982 г., когда метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза впервые был при­менен для модификации генов некоторых ферментов, в том числе фер­мента с известной пространственной структурой (тирозил-тРНК-синте-тазы). Именно на примере этого фермента большой коллектив специали­стов по энзимологии, рентгеноструктурному анализу и генной инженерии, возглавляемый известным английским энзимологом А. Ферштом, проде­монстрировал поражающие воображение возможности нового методаг. Этим авторам не только удалось повысить скорость работы фермента в 30 раз с помощью одной заранее предвиденной точечной мутации; они впервые получили (в работах 1984—1986 гг.) убедительные эксперимен­тальные доказательства справедливости фундаментального механизма ферментативного катализа, предложенного Дж. Холдейном (1930 г.) и -Л. Полингом (1946 г.),—механизма стабилизации переходного состояния субстрата за счет повышенного сродства фермента именно к этому со­стоянию.

Особенно важно то, что авторы работ этого цикла вводят в фермент точечные аминокислотные замены не вслепую и не на основе приблизи­тельных соображений. Знание детальной трехмерной структуры белка позволяет выбрать наиболее эффективные аминокислотные замены для проверки четких и разумных предположений — о роли водородных свя­зей фермента с субстратом, об особенно прочном связывании переходного состояния и т. д.

Значительный интерес представляет также серия работ известного американского кристаллографа Б. Мэтьюза и его сотрудников3, в кото­рых были расшифрованы пространственные структуры лизоцима фага Т4 и многих его точечных мутантов (как природных, так и полученных путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Замечательным ре­зультатом этих исследований является установление факта, что почти все изученные мутации не приводят к сколько-нибудь заметным измене­ниям строения белка: обычно имеют место небольшие смещения одной или нескольких окружающих боковых групп. Более того, хотя некоторые мутации заметно понижают температуру плавления белка, все исследо­ванные мутанты лизоцима фага Т4 сохраняют свою стабильность при комнатной температуре. Аналогичные результаты были получены М. Пташне с сотрудниками для мутантов фаговых репрессоров 4. Из этих работ следует, что далеко не все детали аминокислотной последователь­ности белка важны для приобретения им стабильной пространственной структуры — белок спокойно выдерживает много природных и искусст­венных аминокислотных замен.

Некоторые исследователи перешли от констатации влияния аминокис­лотных замен на термостабильность белков к направленному повышению термостабильности с помощью олигонуклеотид-направленного мутагене-

2 Fersht A. R. е. а.Ц Angew. Chem. (Int. Engl. edit.). 1984. V. 23. P. 467-473; Leatherbarrow R. J., Fersht А. Й.//Protein Engineering. 1986. V. 1. P. 7 — 16.

3 Alber T. e. a. // Protein Structure, Folding & Design. A. R. Liss. Inc. 1986. P. 307-
318; Alber Т.. Matthews B. W. // Methods in Enzymology. Part E. 1986.

4 Wharton R. P., Brown E. L., Ptashne M. // Cell. 1984. V. 38. P. 361-369; Whar­
ton R. P. e. a. H
Nature. 1985. V. 316. P. 601-605.

Конструирование белковых молекул

105

за. Для этой цели используется замена сближенных (в природном белке) остатков на остатки цистеина, приводящая к образованию дополнитель­ных дисульфидных связей5, повышение стабильности вторичной струк­туры 6 и т. д. Направленный мутагенез успешно используется для изме­нения специфичности белков, рН-зависимости активности ферментов7 и других свойств. Особый интерес представляют первые работы по влиянию точечных аминокислотных замен на сворачивание белков8, в которых показано, что иногда даже точечные мутации могут блокировать послед­нюю стадию сворачивания белка.

Конструирование белков: структурный каркас и активный центр

Задачи, решаемые белковой инженерией в па-стоящее время, сводятся либо к рекомбинации природных функциональ­но-структурных блоков, либо к модификации природных белков и, в част­ности, их активных центров. Однако можно предвидеть, что уже в бли­жайшее время в повестке дня появится гораздо более интересная и действительно фундаментальная задача, решение, которой сразу имело бы огромное практическое значение,— создание искусственных белков с за­ранее рассчитанной пространственной структурой и/или с заранее задан­ными новыми свойствами, то есть конструирование белковых молекул.

Основываться такое конструирование должно на развивающихся в настоящее время физико-химических теориях белковых структур и фер­ментативного катализа. В свою очередь развитие этих теорий должно рез­ко ускориться после того, как белковая инженерия предоставит исследо­вателям возможность целенаправленно экспериментировать со структурой и функцией белков и оперативно уточнять теоретические предсказания.

Хорошо известно, что трехмерная структура белковой цепи возникает под действием внутренних сил (самоорганизация). Поэтому, если мы хо­тим сделать новый белок с заданным строением и свойствами, то мы должны создать такую аминокислотную последовательность, которая ко­дировала бы проектируемую пространственную структуру, включая и трехмерную организацию активного центра белка. Поэтому прежде всего предстоит добиться ясного понимания, как первичная структура (амино­кислотная последовательность) белка кодирует его пространственную структуру и каким образом эта пространственная структура определяет функциональную активность молекулы.

Два направления таких исследований представляются нам наиболее перспективными.

1. Создание набора «белкового конструктора» для построения белков с заданной архитектурой (трехмерной структурой).

Возможность постановки такой задачи определяется недавними успе­хами в разработке методов расчета архитектуры белка по его аминокис­лотной последовательности: теории вторичной структуры белков 9, общей теории укладки вторичной (а- и [5-) структуры в компактную белковую

5 Perry L. J., Wetzel R. 11 Science. 1984. V. 226. P. 555-557; Villajranka J. E. e. a. //
Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1986. V. A317. P. 405-413.

6 Hecht H. H., Sturtevant J. M., Saner R. T. // Proc Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81.
P. 5685-5689; Mitchinson C, Baldwin R. L. // Proteins. 1986. V. 1. P. 23-33.

7 Craik С S. e. a. //Science. 1985. V. 228. P. 291-297; Thomas P. G., Russel A. /.,
Fersht A. R. // Nature. 1985. V. 318. P. 375-376.

8 Craig S. e. a.//Journ. Mol. Biol. 1985. V. 185. P. 681-697.

9 Ptitsyn О. В., Finkelstein A. V. II Biopolymers. 1983. V. 22. P. 15-25.

На основных направлениях науки

106

глобулу 10 и разрабатываемого в настоящее время алгоритма определения этой укладки для каждой заданной аминокислотной последовательно­сти и. Можно думать, что задача предсказания общей архитектуры бел­ковой молекулы уже близка к принципиальному решению, хотя впереди еще долгий путь до разработки общего алгоритма и, тем более, до расче­та трехмерной структуры в атомарном разрешении. Однако уже сейчас можно отважиться на расчет «белка», собранного из «белкового конструк­тора», тем более, что мы можем облегчить свою задачу, взяв в качестве элементов «конструктора» наиболее удобные для расчета аминокислотные последовательности. Расчет структуры такой белковой «конструкции», безусловно, окажется несравненно проще, чем расчет природного белка. «Строительными блоками» в проектируемом конструкторе могут служить последовательности, кодирующие «мощные» (внутренние стабильные) а-спирали, ^-участки, антипараллельпые и параллельные (3-шпильки, изгибы и т. д. Помимо высокой внутренней стабильности а- и (3-струк-турные блоки должны обладать четкими гидрофобными поверхностями для «слипания» друг с другом.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти строительные блоки, должны обладать «удобными» для ферментативного сшивания кон­цами. И тогда действительно может получиться удобный «набор-конструк­тор» и на уровне белковых блоков, и на уровне фрагментов генов.

Соответствующие «идеальные» последовательности можно, конечно, спроектировать, исходя из теории вторичной структуры белков (рис. 1, а, б), а затем химическим путем синтезировать кодирующие их фрагменты генов. Для небольшой «белковой конструкции» можно не толь­ко рассчитать ее вторичную структуру (рис. 1, в), но даже рискнуть предсказать ее трехмерную архитектуру (рис. 1, г). Но на практике, видимо, пока что проще пойти другим путем: отыскать в имеющемся бел­ке генов такие нуклеотидные последовательности, которые легко выщеп-ляются рестриктазами и в то же время кодируют аминокислотные после­довательности, дающие достаточно мощные (пусть и далекие от идеаль­ных, согласно той же теории вторичной структуры,) а-спирали, ^-структуру и т. д. (рис. 2). Сшивая эти блоки, можно получить, сначала теоретически, белок с ярко выраженной вторичной структурой и определить наиболее вероятную третичную структуру этой молекулы. Далее эстафета должна перейти к эксперименту: взять соответствующие куски генов, сшить их между собой и пришить к гену маркерного белка-носителя (рис. 2, в); это позволит детектировать целевой, но не «работающий» ис­кусственный белок. Затем нужно отделить «конструкцию» от маркера, выделить и накопить ее в количестве, достаточном для структурных ис­следований. А затем либо продемонстрировать образование предполагае­мой структуры (и уточнить ее детали), либо опровергнуть результаты теоретического «конструирования».

В качестве маркерного белка-носителя может быть взят, например, белок A. S. aureus, входящий в комплекс иммуноглобулинов человека. Иллюстрацией этого являются работы, в которых были сконструированы различные гены гибридных белков, состоящих из сигнального пептида, пяти доменов маркерного белка А (либо его фрагментов) и генов целе-вых белков12. Для выделения рекомбинантного белка применяется аф-

10 Ptitsyn О. В. II Proc. Int. Symp. Biomol. Struct. Interactions, Suppl. Journ. Biosci.
1985. V. 8. P. 1 — 13; Птицын О. Б., Финкелъштейн А. В., Мурзин А. Г. // Молекуляр
биология. 1986. Т. 20. С. 21-28.

11 Финкелъштейн А. В. // Матер. VI симпоз. по конформационным изменениям
биополимеров в растворе. Тбилиси. 1985. С. 5.

12 Uhlen Н. е. a. //Journ. Bacteriol. 1984. V. 159. P. 713-719; Abramsen L. e. a. II
EMBO Journ. 1985. V. 4. P. 3901-3906.

Конструирование белковых молекул

107



финная хроматография на иммуносорбенте (рис. 3). Таким образом, в одну стадию из фракции суммарных белков штамма продуцента удает­ся получить практически чистый гибридный белок.

Основной трудностью программы «белок-копструктор» и в то же вре­мя важнейшим вопросом, на который она может дать ответ, является про­блема пространственной стерической «совместимости» разных фрагмен­тов, произвольно сшитых в единую цепь. Дело в том, что нативные белки отличаются жесткой пространственной структурой с очень плотной (ква­зикристаллической) упаковкой боковых групп в ядре белковой глобулы. Совсем не очевидно, что искусственная белковая цепь, сконструированная по описанной выше методике, может обеспечить такую упаковку — ведь

^ На основных направлениях науки

108













^ Конструирование белковых молекул 109

при проектировании пока что учитывается только стабильность вторич­ной структуры и ее способность к слипанию.

Возможна альтернатива: или плотная упаковка достигается лишь в стратегически подобранных эволюцией последовательностях — и тогда в искусственном белке ее надо тщательно сконструировать (не совсем ясно, как); или же плотная упаковка гидрофобного ядра может возникнуть (в подходящих условиях) спонтанно — и тогда ее не нужно проектиро­вать специально. Исходя из множества и разнообразия аминокислотных замен в природных белках, мы предполагаем, что образование плотной упаковки не должно налагать слишком больших ограничений на первич­ные структуры. Об этом же свидетельствует сохранение структуры и ста­бильности белков при многих искусственных и естественных аминокис­лотных заменах, включая и замены в гидрофобном ядре молекулы.

Итак, эксперименты с «белковым конструктором» могут многое про­яснить в принципах построения общей архитектуры белковой молекулы; однако здесь остался в стороне вопрос об организации активного центра. Другая серия экспериментов нацелена как раз на конструирование ак­тивного центра белковой молекулы.

2. «Прививка» активного центра одного белка к другому белку. Из­вестно, что белки с совершенно разной архитектурой могут иметь оди­наковые или сходные активные центры и биохимические функции.

Можно ли белковую молекулу уподобить каркасу с закрепленным на нем активным центром? Как положительный, так и отрицательный ответ на этот вопрос имел бы огромное значение не только для конструирова­ния белков, но также и для вопроса о возникновении функционирующих белков в природе.

В случае положительного ответа можно не только слегка модифици­ровать природный активный центр, но и создать на белке в другом месте другой центр с новой функцией путем точечных замен нескольких по­верхностных аминокислотных остатков. Особенно удобно провести такие изменения в тех участках белковой молекулы, где в нативной исходной молекуле пространственное расположение аминокислотных остатков уже «напоминает» желаемый (каталитический, лигандсвязывающий, рецеп-торный, антигенный и т. п.) активный центр (рис. 4).

^ На основных направлениях науки, 110



Конструирование белковых молекул 111

I [редварительный анализ пространственных структур ряда белков, проведенный А. В. Финкелынтейном и А. Г. Головинской, показал, что такие «потенциальные активные центры» довольно часто встречаются на поверхности белковых глобул. Так, например, на поверхности рибонук-леазы было найдено несколько группировок из трех остатков каждая, сходных (с точки зрения взаимного расположения Ср- и Ст-атомов) с ка­талитической триадой Ser 195 — His 57 — Asp 102 (рис. 5, а) в сериновых протеазах трипспнового типа; наиболее перспективная для «прививки» тройка аминокислотных остатков рибонуклеазы показана на рис. 5, б. Координаты Сц- и Cr-атомов этой тройки боковых групп соответствуют координатам аналогичных атомов каталитической триады трипсина с точностью около 0,5 А (то есть с точностью, характерной для сходства каталитических центров разных сериновых протеаз), а поблизости этой «тройки» имеется нечто, напоминающее субстратсвязывающую площадку.

Сама «прививка» активного центра может осуществляться олигонук-леотид-направленными мутациями (см. рис. 4), призванными обеспечить, в данном случае, замены Met 29-*-His 29, Туг 25-*Asp 25, Asp 14-*Ser 14. Еще несколько мутаций может потребоваться для «улучшения» субстрат-связыВающей площадки и создания субстратной специфичности.

В данном случае прививаемый активный центр «списан» с природного белка и теоретически «привит» к другому природному белку. Еще заман­чивее было бы привить к специально сконструированной белковой глобу­ле «новый» активный центр, специально спроектированный на основе квантово-химических расчетов для выполнения каталитической или ка­кой-нибудь другой важной и нужной функции.

Перспективы белковой инженерии выглядят поистине захватывающи­ми как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения возможных практических приложений. Эти перспективы несомненно оправдают любые усилия, которые придется затратить в исследованиях этой «точки роста» современной науки.

УДК 547.96:541.6

Похожие:




©fs.nashaucheba.ru НашаУчеба.РУ
При копировании материала укажите ссылку.
свазаться с администрацией